日前，華東師范大學李大力、王立人團隊和上海交通大學基礎醫學院曾凡一課題組合作開發了三個高精準型的haA3A-CBE系列胞嘧啶堿基編輯器，在兼顧高精準度和極低脫靶活性的同時，在以往的高精度編輯器活性非常低的甲基化區域和GC序列背景位點表現出顯著活性和安全性優勢，并通過目前基因治療常用的腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）或脂質納米顆粒（lipid nanoparticles，LNP）遞送技術，在遺傳性酪氨酸血癥的小鼠模型體內實現了精準高效編輯，達到治愈的療效。
這三個高精準型的胞嘧啶堿基編輯器可以比較安全、高效且精準地去糾正一些造成遺傳疾病的基因突變，有望對特定突變的遺傳病徹底治愈。
華東師大生命科學學院博士生導師李大力研究員
“我們主要是對遺傳病或者說基因治療開發了一個相對更加安全和精準的基因編輯工具。”李大力研究員介紹說，如果有些遺傳病是因為A:T>G:C堿基突變所致，該工具極有可能去糾正這個遺傳突變進行治療，而且理論上來說不太會產生副作用。
“主要是它的精確性比較高，將來用于臨床的話，前景還不錯，因為安全性不錯。”李大力說道，對于安全性，他們做了大量的驗證，然后也做了一些遺傳病的治療研究，這些治療研究在小鼠遺傳疾病模型里面可以看到特別好的療效。
“我們參加了上海交通大學醫學院的‘上海高水平地方高校創新團隊’項目。”在上海市教委這個項目以及前沿科學基地等項目的支持下，華東師大李大力、王立人團隊和上海交通大學基礎醫學院曾凡一課題組就遺傳病方面的治療開展了合作。“因為兒童醫院接診的遺傳病患者比較多，他們也對遺傳病的治療比較感興趣，雙方具有天然的優勢，所以合作非常順利。雖然現在還處于臨床前的基礎研究階段，我們希望將來有機會能夠在臨床上做一些應用。”
華東師范大學李大力、王立人團隊
據介紹，目前已知的人類遺傳疾病大部分由堿基突變引起，堿基編輯器（Base editors, BE）以其獨特的作用原理，在不依賴DNA雙鏈斷裂和修復模板的條件下，可在不同類型細胞基因組中實現高效堿基轉換，在基礎研究和人類遺傳疾病的治療中極具應用價值。其中胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editor, CBE）由胞嘧啶脫氨酶，Cas9切口酶（nickase Cas9, nCas9）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI）組成，可以誘導高效C-to-T堿基轉換。然而，CBE的寬編輯窗口容易導致靶點內多個堿基被同時編輯，產生旁觀者編輯，大大降低了編輯精度。此外，胞嘧啶脫氨酶的單鏈DNA和RNA結合活性易導致隨機性DNA和RNA脫靶編輯，存在安全隱患。
通過蛋白改造，研究人員開發了如YE1-BE3，FE1-BE3和R33A-BE3等編輯窗口窄，脫靶活性低的精準型CBE，然而它們都是基于rAPOBEC1開發的，難以高效編輯甲基化位點和GC序列背景中的C堿基。在需要通過C-to-T堿基編輯糾正的人類致病突變中，約有43%位于CpG二核苷酸中，而哺乳動物基因組CpG中的C通常是甲基化的。基于hAPOBEC3A開發的A3A-CBE可以高效編輯此類C堿基，然而它具有很寬的編輯窗口和極高的脫靶活性，不具備編輯精確性和安全性。同樣是基于hAPOBEC3A開發的eA3A-CBE具有很低的脫靶活性，并對TCR motif具有偏好性，可實現對該motif中的C的精確編輯，然而序列偏好性限制了它的靶向范圍。因此，開發適用于所有序列背景的精準型CBE對基礎研究和人類遺傳疾病的治療具有重要意義。
為了開發能夠在多種序列背景下實現高效堿基編輯的精準型CBE，華東師大李大力、王立人團隊和上海交通大學基礎醫學院曾凡一課題組的研究利用hAPOBEC3A構建了A3A-BE4max，并基于hAPOBEC3A的晶體結構進行理性設計，通過正交R-loop實驗篩選低脫靶活性突變體。結果顯示Y130A突變體可以在保留高編輯活性的同時，顯著降低Cas9非依賴型脫靶，縮小編輯窗口，并且沒有表現出固定的序列偏好性。進一步在Y130位點引入其他突變，或在Y130A基礎上引入組合突變，經篩選發現Y130P和VA（I96V+Y130A）突變體在靶向編輯活性和脫靶編輯活性上保持了較好的平衡，Y130G和TA（I96T+Y130A）突變體具有最低的脫靶活性。綜合考慮靶向編輯活性，脫靶編輯活性和編輯窗口，將Y130A、VA和Y130G突變體選為高精準型A3A-CBE（haA3A-CBE），分別命名為haA3A-CBE-A、haA3A-CBE-VA和haA3A-CBE-G。為了進一步評價haA3A-CBE的編輯活性和窗口，研究者在多種序列背景下對它們進行了測試。結果顯示haA3A-CBE在甲基化位點的編輯活性顯著高于YE1-BE4max，在GC和AC序列中的編輯效率顯著高于YE1-BE4max和eA3A-BE4max，它們的高活性窗口位于protospacer的6-7位。此外，研究者通過全基因組測序和RNA測序驗證了haA3A-CBE具有極低的脫靶活性。
為了評估haA3A-CBE在基因治療中的高效性和精準性，研究者構建了9個含有人類致病SNV的細胞系。經測試發現haA3A-CBE可以高效且精確地糾正其中6個SNV，并在兩個位于GC序列背景的SNV上展現出相對于YE1-BE4max 1.7-4.8倍和1.9-3.3倍的編輯效率。然而，haA3A-CBE在糾正另外3個SNV的同時引入大量旁觀者編輯，研究者通過將haA3A-CBE中的nSpCas9替換為nSpCas9-NG，拓寬其靶向范圍構成haA3A-CBE-NG，并通過合理設計sgRNA將旁觀者C置于編輯窗口之外，大大提高了編輯精確性。為了進一步測試haA3A-CBE的基因治療潛能，研究者通過AAV遞送haA3A-CBE-G到一型酪氨酸血癥小鼠肝臟，精確高效糾正了Fah基因突變的起始密碼子，有效防止了肝損傷表型。然而，研究者發現隨著時間的推移，旁觀者編輯增加，推測是AAV遞送的haA3A-CBE-G在小鼠體內長期表達的結果。隨后，研究者利用LNP遞送haA3A-CBE-G或haA3A-CBE-VA的mRNA和sgRNA在該小鼠體內實現了更為精確的編輯（見下圖），提示了基因編輯工具瞬時性表達的重要性。
haA3A-CBE精準高效糾正一型酪氨酸血癥小鼠Fah基因突變的起始密碼子
總的來說，haA3A-CBE具有窄編輯窗口和極低脫靶活性，更重要的是它們能夠在多種序列背景下實現高效堿基編輯，尤其是對甲基化位點和GC序列背景位點的C堿基具有高效編輯能力，豐富了堿基編輯工具箱，是治療人類遺傳疾病非常有前景的編輯器。
3月29日，華東師范大學李大力、王立人團隊和上海交通大學基礎醫學院曾凡一課題組在Nature Chemical Biology 雜志發表了這一研究成果。
華東師范大學李大力、王立人團隊和上海交通大學基礎醫學院曾凡一課題組合作在Nature Chemical Biology 雜志發表研究成果
從左至右為王嫚、楊磊、霍雅楠
華東師范大學生命科學學院博士后楊磊、博士研究生霍雅楠、碩士研究生王嫚（現為東南大學博士研究生）以及博士后張丹為該論文的共同第一作者，華東師范大學為第一單位，華東師范大學李大力研究員、王立人副研究員和上海交通大學基礎醫學院曾凡一為論文通訊作者。華東師范大學生命科學學院劉明耀教授、宋高潔研究員、程義云教授、呂佳研究員、關玉婷研究員、北京大學伊成器教授及香港中文大學馮波教授等對該項研究提供了重要支持。該研究受到了科技部重點研發計劃、國家自然科學基金、中國博士后科學基金以及上海市教委前沿科學基地和重大項目等支持。
來源｜生命科學學院、科技處 采寫｜田波瀾 編輯｜沈韻婷 編審｜郭文君
